作者：田海丽、李蓉，上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院

伴随社会经济的发展、文明的进步, 生育年龄推迟已成为全球性问题。我国由于全民学历水平的提高、工作压力的增加、生育观念的改变,女性生育年龄也普遍推迟。近年来随着“二孩”政策的全面放开, 有生育需求的高龄女性进一步增多。而与其他器官相比, 卵巢是最易受年龄影响的器官[1], 35岁以后卵巢功能衰退加剧[2]。年龄相关的卵巢功能自然衰退由卵泡数量减少和卵母细胞质量下降共同决定[3], 多因素导致的卵母细胞质量下降主要与其超微结构改变、线粒体功能减退、端粒变短、端粒酶活性下降和染色体非整倍体率增加相关[4]。线粒体提供受精和植入前胚胎发育所需的三磷酸腺苷(ATP), 并且还作为细胞内钙储存库, 在卵母细胞中起重要作用, 是卵巢衰老的决定因素[5]。与年轻女性相比,高龄女性卵母细胞数量减少、质量下降和生殖成功率降低,通常是生殖中心患者中最具挑战性的患者[6]。本文对线粒体与卵巢衰老之间的关系以及改善卵母细胞质量的相关治疗策略作一综述, 以期为临床应用和研究提供一定的指导。

1 线粒体与线粒体DNA(mitochondrial DNA, mt DNA)

1.1 线粒体       

线粒体是卵细胞质中含量最为丰富的细胞器,作为细胞内的能量工厂, 通过氧化磷酸化提供卵母细胞成熟、受精及胚胎发育的全部能量。除此之外, 线粒体在钙稳态、信号转导及细胞凋亡的调节、脂肪酸氧化、氧化应激、Fe-S 蛋白合成、血红素和嘧啶合成中均起重要作用[7]。在卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中, 线粒体也存在数目、分布及功能的变化。卵母细胞内 mt DNA 在卵母细胞成熟过程中不断复制, 成熟卵母细胞mt DNA 拷贝数至少为100 000, 卵母细胞成熟后复制停止, 直到囊胚期才恢复[8]。卵母细胞受精后通过卵裂使胚胎细胞数目不断增多, 而线粒体数目从第二次减数分裂中期(MII)期到胚胎着床期是不增加的, 为了提供维持胚胎发育所需的更多的ATP, 线粒体只能通过改变自身结构来提高工作效率[9]。从生发泡期(germinal vesicle, GV)到生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)后的卵母细胞中, 活性线粒体分布由细胞质周边区转至核周边区, 这可能与减数分裂过程中纺锤体聚集、线粒体浓集和移动以及极体排出等需要较多能量有关。线粒体可分为成熟和不成熟两大类。成熟线粒体呈椭圆形、嵴数目多、内膜面积大、基质密度低、ATP 产能多, 而不成熟线粒体呈球形、嵴数较少、功能较低、基质密度高、ATP 产能少, 从卵母细胞到桑椹胚阶段, 成熟线粒体比例不断增加, 到囊胚阶段, 所有细胞中线粒体基本上均为成熟线粒体[10]。

1.2 mt DNA  

卵母细胞中存在两种不同的基因组。一个位于细胞核中, 以孟德尔方式遗传, 另一个位于线粒体内, 通过母系遗传。故线粒体内含有独立于核 DNA(n DNA)之外的一组遗传物质, 称之为 mt DNA, 具有复制、转录、翻译、传递与表达完整的遗传信息的特点。mt DNA 是一组大小为16 569 bp、缺少组蛋白高度扭曲的双链闭合环状 DNA 分子。卵母细胞中的线粒体只含有 1 个或 2 个 mt DNA 基因组,从而可以通过 mt DNA 拷贝数的定量分析来估计线粒体数量。呼吸链总共需要约 83 个亚基, 其中 mt DNA参与编码的共有 13 个蛋白质亚基:  复合物Ⅰ中的 ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5 和 ND6; 复合物 III 中的细胞色素 b; 复合物Ⅳ中的 COⅠ、COⅡ和 CO Ⅲ; 和复合物 V 的 ATP 酶的亚单位6和8, 其余70个亚基由核基因编码并被导入线粒体。此外, mt DNA 还含有 2 个核糖体亚基和 22 个转移 RNA[11]。线粒体功能受到可利用底物以及与之高度特异性交流的核基因组的共同调节[12]。

2 线粒体与卵巢衰老

2.1 线粒体是卵巢衰老的决定因素   

卵巢衰老是受多因素影响、逐渐积累、连续复杂的生物过程, 伴随与氧化磷酸化功能降低相关的卵母细胞线粒体数量下降、结构改变及产能降低。线粒体作为细胞质中最重要的细胞器, 在卵母细胞成熟和胚胎发育过程中起关键作用, 线粒体功能障碍和mt DNA突变影响卵母细胞正常发育, 线粒体是卵巢衰老的决定因素[13-14]。目前关于卵母细胞老化的学说主要包括: 非整倍体学说、氧自由基 - 线粒体损伤学说等。非整倍体即染色体数目异常, 具有3个一般特征: ①在大多数情况下, 额外的染色体是母体来源的; ②大多数发生在第一次减数分裂(metaphase I, M I)过程中, 由同源染色体错误分离所引起;③母亲年龄是迄今为止唯一被证实的与出生时非整倍体发生风险相关的病因, 未受精卵母细胞的非整倍体发生率随母亲年龄增加而上升, 染色体非整倍体发生率最低的时期是在26~30岁之间, 而高龄组的非整倍体发生率较高[15-16]。真核生物的姐妹染色单体通过环状复合体——黏连素相连,母亲年龄相关的非整倍体发生率增加与黏连素随着母亲年龄的增加而逐渐丧失相关[17]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是正常有氧代谢的产物, 正常情况下, ROS的产生和清除保持动态平衡, 生理水平的ROS通过各种信号转导途径在卵泡发生、卵母细胞成熟、子宫内膜周期性变化、胚胎植入、胚胎发育和妊娠等方面发挥重要的调节作用[18]。但是当线粒体功能下降, ROS产生增加或细胞抗氧化机制受损时, 可造成ROS的累积, 导致细胞氧化应激(oxidative stress,OS)损伤。OS可导致卵母细胞内线粒体形态和功能的改变,导致 mt DNA 突变, mt DNA 和核 DNA(n DNA)非同步编码电子传递链蛋白质导致呼吸链部分解耦联[19], 进而ATP的合成减少, 进一步增加mt DNA突变和ROS的产生, 以恶性循环的方式导致mt DNA突变呈指数样增加, 进而影响卵母细胞质量和胚胎发育[20]。

2.2 mt DNA拷贝数及mt DNA突变与卵巢衰老 

m t D N A拷贝数对卵母细胞的受精和早期胚胎发育有重要影响, 可作为辅助生殖技术中胚胎活力的潜在生物标志物[21]。大量研究证实, 卵母细胞中线粒体数量影响卵母细胞的成熟、受精以及随后的胚胎发育[22-25], mt DNA拷贝数过低与卵母细胞受精失败和质量低下相关, 与此同时, mt DNA拷贝数过高也与胚胎发育阻滞存在相关性[ 2 6 ] 。尽管对于成熟卵母细胞mt DNA具体的拷贝数存在较大争议, 但目前学界普遍认为绝大多数哺乳动物卵母细胞 mt DNA 拷贝数应该是 105 数量级。mt DNA 具有独特的遗传特征: 母系遗传、异质性、复制分离、阈值效应、广谱性和高突变率等[27]。线粒体通过氧化磷酸化(OXPHOS)产生 ATP 的过程通常伴随毒性产物ROS 的产生, ROS 可以诱导大分子如脂质、蛋白质和 DNA的氧化损伤[28]。与 n DNA 相比, mt DNA 更容易受到氧化损伤和诱变因素的攻击, mt DNA 的突变率比 n DNA 高 10 倍以上, 原因可能为: ①线粒体内膜的脂类含量高, 亲脂性诱导突变的化合物容易在 mt DNA 附近积聚; ② mt DNA 位于产生 ROS 最多的细胞器(线粒体)内, 持续暴露于OXPHOS的毒性副产物ROS中, 可促进 mt DNA 突变和 OXPHOS 解耦联,正反馈加剧 ROS的产生; ③ mt DNA的物理位置靠近电子传递链使其易害; ④ mt DNA缺乏内含子,更易发生功能突变; ⑤ mt DNA 缺完善的 DNA 切除修复机制(维护和修复损伤的 mt DNA 酶与保持核基因组的酶相同, 然而这些酶不适合修复mt DNA,  使其修复效果较差); ⑥ mt DNA处于不断合成状态, 使其易受外界干扰, 稳定性较差; ⑦卵母细胞和原始卵泡在生长和发育为成熟卵母细胞之前可在卵巢内存在长达50年, 使mt DNA损伤易于积累[29]。mt DNA 突变与年龄和哺乳动物老化表型相关, 随着年龄增加, mt DNA突变率也不断增[30-31]。根据老化的“自由基”理论, 线粒体产能过程中产生的 ROS 可诱导线粒体中磷脂、蛋白质和核酸的损伤, 导致 mt DNA 突变, 引起呼吸链功能障碍, ROS进一步积累和mt DNA突变的进一步增加, 这个恶性循环可能导致mt DNA突变负荷呈指数增加, 这可能导致线粒体 OXPHOS 能力降低、ATP 产生减少、卵母细胞受精率和胚胎发育潜能降低[32]。最常见mt DNA突变是位于第8470位到第12477位之间2组13 bp 的重复片段的?mt DNA4977 片段缺失, ?mt DNA4977 缺失影响ATPase 6和8, 细胞色素氧化酶III和NADQ-Co Q氧化还原酶的几个亚基的表达, 造成上述蛋白亚基缺失或异常, 氧化磷酸化功能异常,产能障碍,导致细胞功能受损和组织衰老[33]。?mt DNA4977 突变已成为衰老的一个重要标志。

3 改善卵母细胞质量的方法

卵巢衰老主要表现为卵母细胞数量减少和质量下降, 伴随卵母细胞线粒体数量减少、结构改变及产能降低, 线粒体是卵巢衰老的决定因素, 改善卵母细胞质量主要是通过改善线粒体功能和增加线粒体数量[34]。

3.1 改善线粒体功能提高卵母细胞质量     

改善线粒体功能的药物目前研究较多的主要包括: 白藜芦醇、褪黑素、左旋肉碱、辅酶 Q10(Co Q10)、脱氢表雄酮(DHEA)、生长激素等[35]。白藜芦醇是可增强线粒体数量和改善线粒体功能的抗衰老化合物[36]。褪黑激素通过其特异性受体调节下丘脑-垂体腺轴中的促性腺激素释放来调节卵巢功能, 除了受体介导的作用外, 褪黑激素还是自由基的直接清除剂[37]。Co Q10存在于所有膜性结构中, 是一种脂溶性电子转运体(将电子从线粒体呼吸链中复合物I和II转运到的复合物III, 对复合物III的稳定性至关重要),并通过ATP 合成酶促进ATP 的形成, Co Q10 是唯一内生合成的脂溶性抗氧化剂, 对脂质、蛋白质和DNA 均有保护作用,年龄相关的卵母细胞质量和数量的下降可以由Co Q10的管理所扭转[38]。体外卵泡培养期间补充左旋肉碱, 最可能通过向卵母细胞和胚胎提供利用脂肪酸所需的基本辅助因子, 增加脂质代谢和改善卵母细胞发育[39-40]。DHEA 可调节卵泡的募集与生长发育, 改善卵巢储备、减少染色体非整倍性的发生率,提高妊娠率、降低流产率, DHEA 合成发生在排卵前约70 d,因此其有效地补充需要在预期行体外受精(in vitro fertilization,IVF)治疗之前约4个月进行[41-42]。生长激素(GH)作为卵巢刺激的辅助, 可通过增强线粒体活性、提高卵母细胞质量和改善临床结果[43]。

3.2  增加线粒体数量改善卵母细胞质量      

随着显微操作技术及生殖遗传研究的发展, 线粒体替代疗法(卵胞质移植、原核移植、纺锤体移植、胚泡移植、极体移植)为提高卵母细胞质量提供了新方向。20世纪90年代末期的临床研究表明, 在卵胞质内单精子注射(ICSI)时, 将从年轻女性的供卵中吸出的细胞质转移到不孕妇女卵中, 可以提高妊娠率[44]。然而卵胞质移植存在伦理争议、伴随线粒体异质性, 而且线粒体本身存在缺失和/或突变的可能, 理论上可能增加罹患遗传性线粒体疾病的风险。此外, 这些程序是在没有事先进行动物研究的情况下进行的, 鉴于缺乏对所涉风险的了解以及对不育症治疗指征缺乏强有力的科学依据, 美国食品和药物管理局在2002年建议, 应暂停供体细胞质转移的技术, 等待进一步研究的结果[45]。为了克服伦理争议和异质性风险, 自体卵巢来源的线粒体移植作为振兴低质量卵母细胞可能的新方法已经引起了广泛关注。2001年Tzeng等[46]首次报道, 通过自体卵丘颗粒细胞线粒体转移(每个卵母细胞约增加3 000个线粒体), 实现了3例临床妊娠, 并指出通过使用从卵丘颗粒细胞向卵母细胞转移线粒体, 可以避免供体和受体mt DNA的异质性。2015年初, 英国在全球率先立法允许线粒体移植[47]。有研究提出[48],用于改善卵母细胞质量的线粒体: ①必须来自患者自身的细胞; ②最佳细胞来源应是卵巢或卵母细胞; ③这些细胞需含有高质量、没有缺失或突变的线粒体。卵巢干细胞(ovarianstem cells, OSC)和完全发育的卵母细胞是可以增强卵母细胞质量的自体线粒体的潜在来源。自体生殖系干细胞线粒体移植(autologous germline mitochondrial energy transfer, AUGMENT)通过ICSI将OSC来源的线粒体与精子一起注射到卵母细胞中,  最大限度地避免异质化风险的同时改善卵母细胞质量, 为改善卵细胞质量提供新方向[49]。然而 Gosden 等[50]提出 AUGMENT操作中: 能够提取多少OSC? 每个OSC含有多少线粒体? 他们的线粒体是否健康? 受移植卵母细胞中线粒体缺陷的证据是什么? 这是如何诊断的? 线粒体被移植的数量? 线粒体移植能否导致ATP 的显着增加? 如果非整倍体在 MII 期预先存在AUGMENT 能否恢复卵母细胞的发育能力等一系列问题至今仍不能清楚回答, 并对 AUGMENT 的临床应用提出了质疑[50]。相比OSCs很难获得并含有相对较少数量的未知质量的线粒体,使用来自IVF, 体外卵泡激活(in vitro follicle activation, IVA)或体外成熟(in vitro maturation, IVM)的剩余的完全生长的卵母细胞, 具有相对容易获得、已经通过线粒体遗传瓶颈并且可能含有高质量线粒体等优点[51]。尽管线粒体替代或线粒体补充疗法为改善卵母细胞质量带来了希望, 但是存在操作的安全性及伦理争议, 至今无法广泛应用于临床, 还需更进一步的研究[52]。

综上所述, 女性年龄相关的生育能力衰退是由卵泡数量减少和卵子质量下降共同决定的, 线粒体参数(如数量、分布和膜电位)、mt DNA  拷贝数及 mt DNA 突变与卵母细胞及胚胎发育能力密切相关, 线粒体是卵巢衰老的决定因素。通过增加线粒体数量和/或改善线粒体功能将有助于提高生育能力。进一步深入了解线粒体与卵巢储备功能降低的关系及探索改善卵母细胞质量的方法, 将有助于为高龄妇女提供更优化的助孕策略, 提高其妊娠率。